اثر  تلقیح باکتری ریزوبیوم بر محصولات کشاورزی، جلسه دوم

هدف: در این پروژه از باکتری ریزوبیوم به عنوان کودی برای گیاه لوبیا استفاده کرده و تاثیرات آن را بر رشد گیاه و کیفیت میوه‌ دهی آن بررسی می کنیم.

حداقل زمان مورد نیاز برای انجام پروژه: 6 هفته

هزینه برآوردی: متوسط

سطح دشواری: سخت

مواد و وسایل مورد نیاز

- دانه‌ هایی از خانواده‌ لگومینوزه مانند لوبیا و گلدان‌ های حاوی خاک برای کاشت آنها

- محیط کشت Y.M.A (در جدول 3 طرز ساخت آن آمده است)

- آگار

- سیکلوهگزامید (با غلظت 20 میلی گرم در لیتر)

- اتانول 96%

- کلرور جیوه

- آب استریل

- کاغذ خشک کن

- نمک طعام

- پلیت پلاستیکی استریل

- لوله آزمایش

- هاون چینی

- سمپلر و یا سرنگ انسولین

- اتوکلاو و انکوباتور

- ست رنگ آمیزی گرم

-  میکروسکوپ و روغن ایمرسیون

روش انجام پروژه

مرحله‌ اول: کاشت گیاه

در این مرحله گیاهی از خانواده‌ لگومینوزه را کشت می ‌دهید. این خانواده شامل گیاهانی نظیر یونجه، شبدر، نخود، لوبیا، عدس و ماش می‌باشد.

از آنجایی که شما برای کشت باکتری خود نیاز به گرهک‌ های روی ریشه‌ این گیاه دارید؛ باید حداقل 4 هفته زمان بدهید تا گیاه خوب رشد کند. به طوری که ظاهر ریشه گیاه شبیه شکل روبه رو شود.

اگر شما در منطقه‌ای زندگی می‌کنید که کشت ‌زارهایی از این قبیل گیاه وجود دارد، خوشحال باشید چون از این مرحله معاف هستید و می‌توانید از گیاهان موجود در آن منطقه نمونه ‌گیری کنید (البته با اجازه‌ صاحب مزرعه).

مرحله‌ دوم: تهیه‌ی محیط کشت Y.M.A

محیط کشت را با توجه به مقادیر ذکر شده در جدول 3 درست كنید. برای جامد کردن محیط کافی است به این مواد 15 گرم آگار اضافه کنید. برای جلوگیری از آلودگی قارچی اضافه کردن 20 میلی‌گرم در لیتر سیکلوهگزامید نیز توصیه می‌شود. بعد از مخلوط کردن مواد ذکر شده و حرارت آن به منظور ذوب آگار، محیط را 15 دقیقه اتوکلاو كنید و در پلیت‌ های استریل بریزید.

مرحله‌ سوم: جدا کردن باکتری از ریشه و کشت در محیط Y.M.A

- گره‌ها را با چند میلی‌متر اتصال از  ریشه جدا كنید (گره‌ های هر گیاه در لوله‌ ای جداگانه نگهداری شوند).

نکته: به رنگ گرهک ‌ها توجه ‌کنید. گرهک‌ های صورتی رنگ توانایی تثبیت ازت بیشتری دارند و آنهایی که زرد و سبز رنگ هستند، فاقد توانایی تثبیت هستند.

-  بر روی هر لوله مشخصاتی شامل نام گیاه، منطقه و تاریخ جمع‌آوری آن را بنویسید.

نکته: درصورتی که بذر تشکیل شده ولی گره وجود نداشته باشد؛ می‌ توان نمونه‌ خاک را به‌ جای گره جمع ‌آوری کرد و از آن ریزوبیوم را استخراج نمود.

در آزمایشگاه:

- گره‌ ها را برای زدودن خاک و خاشاک با آب معمولی شسته، لابلای دو ورق کاغذ خشک کن قرار داده و به آرامی خشک کنید.

- در این مرحله پوشش خارجی گره را تا حد امکان عاری از میکروب کرده تا احتمال وجود باکتری‌هایی غیر از ریزوبیوم را کاهش دهید. لذا گره‌ها را 5 تا 10 ثانیه در اتانول 95% غوطه‌ ور ساخته و به مدت 3 دقیقه در کلرور جیوه 2/0% قرار دهید و بعد از آن 5 تا 6 بار با آب استریل شستشو دهید.

هر بار شستشوی آن حدود 10 دقیقه با آب استریل زمان می‌برد.

دقت كنید که این مرحله در فضایی استریل و کنار شعله انجام گیرد و برای انتقال گرهک ‌ها نیز از وسایلی که با الکل و شعله استریل شده‌اند، استفاده کنید.

- گره‌ها را در یک میلی‌لیتر محلول نمک استریل (5/8 گرم در یک لیتر) بیاندازید.

- سپس آنها را به همراه محلول نمکی، در هاون چینی‌ای که قبلاً با الکل و شعله استریل کرده‌اید، له کنید.

- یک دهم میلی لیتر از سوسپانسیون گره و نمک را بر روی محیط کشت Y.M.A که قبلاً در پلیت درست کرده ‌اید، بریزید. این کار را توسط سمپلر (100 میکرولیتری) انجام دهید.

- پلیت‌ها را در انکوباتور با دمای 28 درجه‌سانتی‌گراد قرار دهید و تا زمانی که کلنی ‌های باکتری نمایان شوند انکوبه کردن را ادامه دهید.

جعبه ابزار زیستی

سمپلر

سمپلر یا میکروپیپت برای کشیدن مایعات در مقادیر کم و بسیار دقیق کاربرد دارد. سه نوع سمپلر بیشترین کاربرد را دارند: اندازه های1 تا 10 میکرولیتر،10 تا 100 میکرولیتر و 100 تا 1000 میکرولیتر.

(هر 1000 میکرولیتر معادل 1 سی سی است.)

برای استفاده از این وسیله ابتدا پیچ سر سمپلر را به اندازه‌ ای می‌‌پیچانیم که عدد روی سمپلر حجم دلخواه ما را نشان دهد. سپس سر سمپلر را تا مرحله یک فشار داده، درون محلول کرده و آرام پیستون را رها می‌کنیم؛ به این ترتیب محلول وارد سر سمپلر (تیپ) می‌شود؛ حالا تیپ را در ظرفی که می‌خواهیم محلول را به آن اضافه کنیم، قرار می دهیم و این بار پیستون را تا مرحله یک و سپس دو فشار داده و محلول را کاملا خارج می‌کنیم.

توجه: تیپ ها باید قبل از کار، اتوکلاو و استریل شده باشند و در انتهای کار نیز قبل از دور انداختن ضدعفونی شوند.

اگر سمپلر نداشتیم چه کار کنیم؟

درصورت نبود سمپلر از پیپت استریل با دقت دهم میلی لیتر و یا سرنگ انسولین استفاده می‌کنیم.

آینده‌ های شغلی یك زیست‌ شناس ـ كارشناس حفظ نباتات

فارغ‌التحصیلان رشته‌های میكروبیولوژی محیطی، كشاورزی، باغبانی و ... می‌توانند به‌ عنوان كارشناس حفظ نباتات در آزمایشگاه‌ های جهاد كشاورزی و سایر مؤسسات تحقیقاتی در حوزه‌ی كشاورزی، وارد بازار كار شوند. هدف این كارشناسان افزایش بازده محصولات كشاورزی، دفع آفات و كاهش خسارات محصولات است.

مطالب مرتبط:

اثر  تلقیح باکتری ریزوبیوم بر محصولات کشاورزی، جلسه اول

اثر  تلقیح باکتری ریزوبیوم بر محصولات کشاورزی، جلسه دوم

اثر  تلقیح باکتری ریزوبیوم بر محصولات کشاورزی، جلسه سوم

اثر  تلقیح باکتری ریزوبیوم بر محصولات کشاورزی، جلسه چهارم

بخش پژوهش های دانش آموزی تبیان، تهیه: مهبان رحیمی فرد

تنظیم: زینب شاه مرادی