اثر تلقیح باکتری ریزوبیوم بر محصولات کشاورزی، جلسه سوم
حداقل زمان مورد نیاز برای انجام پروژه: 6 هفته
هزینه برآوردی: متوسط
سطح دشواری: سخت
ادامۀ روش کار...
مرحله‌ی چهارم: شناسایی باکتری
بدیهی است که در مرحله‌ی جداسازی باکتری ممکن است به دلیل خطا در آزمایش، باکتری هایی غیر از ریزوبیوم نیز رشد کرده باشد. می‌توانید از چند ویژگی ریزوبیوم که در زیر آمده است، برای شناسایی آن استفاده كنید:
1- رنگ آمیزی گرم
همان طور‌که می‌دانید باکتری ها بر‌اساس جنس دیواره شان به دو گروه بزرگ گرم مثبت و گرم منفی تقسیم می‌شوند. باکتری ریزوبیوم گرم منفی است بدین معنا كه بعد از رنگ آمیزی به رنگ قرمز در می‌آید.
تصویر میکروسکوپی ریزوبیوم.
2- مورفولوژی و شکل میکروسکوپی باکتری
بعد از رنگ آمیزی ریزوبیوم، باید زیر میکروسکوپ شكل کوکوباسیل (کروی‌میله‌ای) مشاهده کنید.
3- تست حرکت
باکتری ریزوبیوم یک باکتری متحرک است.
چه طور می‌توان فهمید یک باکتری متحرک است؟
1- کشت در محیط نیمه جامد (Semi-solid Agar)
ابتدا باید محیط نیمه جامد را درون لوله آزمایش درست كنید. سپس فیلدوپلاتین سوزنی آغشته به باکتری را به طور مستقیم و بدون لرزش دست وارد محیط کرده و بیرون آورید. در صورتی که باکتری متحرک باشد، بعد از انکوباسیون کل محیط کدر می‌شود.
کشت باکتری در محیط نیمه جامد لوله سمت راست حاوی اکتری متحرک و لوله سمت چپ غیر متحرک است.
2- روش لام مرطوب (Wet mount)
یک قطره از محیط آبی که واجد میکروارگانیسم است را، روی لام قرار داده و بلافاصله لاملی روی آن گذاشته و زیر میکروسکوپ مشاهده کنید. چون با لنز 100 میکروب ها را بررسی می‌كنید، قطره کوچکی از روغن ایمرسیون نیز بر روی لامل قرار دهید. اگر باکتری متحرک باشد، حرکت سطحی آن را زیر میکروسکوپ می توان دید.
3- روش قطره‌ی معلق (Hanging drop)
یک قطره از سوسپانسیون مایع حاوی باکتری روی مرکز لامل قرار دهید. چهار طرف لامل را وازلین مایع توسط پیپت پاستور قرار می دهیم. سپس «لام تو گود» (Depression slide) را به طور معکوس روی لامل قرار دهید، به طوری که مایع در وسط گودی لام قرار گیرد.
بلافاصله بعد از این کار لام را بر برگردانید تا سوسپانسیون میکروبی در گودی لام معلق شود. به این ترتیب می توان حرکت عمقی باکتری را نیز زیر میکروسکوپ بررسی کرد.
4- تلقیح (Inoculation) در گیاه
این روش زمان بر است اما روشی بسیار مطمئن برای شناسایی است. برای این کار باید گیاه میزبان را در شرایط کاملاً استریل کشت دهید و آن را با باکتری های استخراج شده تلقیح کنید. در صورتی که بر روی ریشه ها گره تشکیل شد می توان ادعا نمود که باکتری، ریزوبیوم است.
ایجاد گره بر روی ریشه
اما تلقیح گیاه یعنی چه؟
تلقیح عبارتست از کاربرد ریزوبیوم و اسقرار آن بر روی بذر آماده کشت و یا اضافه کردن باکتری در محیط خاک به منظور آلوده سازی ریشه با باکتری موردنظر و در نتیجه ایجاد همزیستی و تولید گره بر روی ریشه به منظور تثبیت نیتروژن هوا.
از زمان های بسیار دور نیز کشاورزان به تجربه دریافته بودند که برای محل جدید کشت غلات، خاک زمینی که قبلاً در آن بقولات کشت شده اند، به استقرار و رشد گیاه جدید کمک بزرگی می‌کند و محصولات پس از بقولات تولید بالاتری دارند. در حقیقت کشاورزان آن زمان بدون خبر داشتن از وجود باکتری ریزوبیوم از خواص تثبیت نیتروژن آن استفاده می‌کردند.
مرحله پنجم- ساخت مایع تلقیح و تلقیح باکتری به گیاه
در این مرحله نیاز است که محیط Y.M بدون آگار ساخته شود (طبق دستورالعمل مرحله دو). بعد از استریل کردن محیط، از باکتری ریزوبیومی که جدا کرده ایم در محیط مایع کشت دهید و آن را حدود 5 روز انکوبه کنید. به این ترتیب مایع تلقیح آماده است و نوبت به تلقیح گیاهان می‌رسد.
برای تلقیح گیاه دو روش می توانید به کار ببرید:
1- بذر گیاه را در تماس با مایع تلقیح قرار دهید بدین صورت که دانه را در محلول تلقیح چند ساعت خیس کنید.
2- مایع تلقیح را به خاک اضافه کرده و در تماس با ریشه گیاه قرار دهید.
در هر گروه حداقل 20 دانه وجود دارد و برای هر دو روش، یک گروه شاهد نیز در نظر گرفته می شود که در روش اول دانه های شاهد را در آب خیس كنید و در روش دوم به اندازه مایع تلقیحی اضافه شده به گیاه، به شاهد آب داده می شود.
میزان و دفعات دادن مایع تلقیح به گیاه نیز می‌تواند از متغیرهای پروژه باشد و برای مثال گروه هایی داشته باشید که هر روز، یک روز درمیان و یا هفته ای یکبار سوسپانسیون باکتری را دریافت می‌کنند.
نتایج قابل مشاهده
بررسی کیفی
رنگ برگ گیاهان چهار گروه را با هم مقایسه و درجه بندی کنید. سیستم درجه بندی بر این اساس است: 1- خیلی زرد، 2- متمایل به زرد، 3- متمایل به سبز، 4- سبز روشن، 5- خیلی سبز.
رنگ گرهک های ریشه بررسی شوند: 1- سفید رنگ (غیر فعال است)، 2- قرمز مایل به صورتی (فعال)، 3- سبز و قهوه‌ای (غیر فعال).
ویژگی های خاک در دسترس گیاه ازجمله pH و اندازه‌ی ذرات خاک را نیز بررسی كنید.
بررسی کمی:
تعداد گرهک های ریشه گیاهان در چهار گروه شمارش و مقایسه شوند.
وزن اندام های هوایی چهار گروه اندازه‌گیری و مقایسه شوند.
وزن ریشه گیاهان نیز مقایسه شوند.
سؤالاتی كه بعد از انجام پروژه می‌توانید به آنها پاسخ گویید.
1- آیا بین تعداد گرهك های ریشه و وزن اندام های هوایی آن ارتباط معنا داری وجود دارد؟ توضیح دهید.
2- كدام یك از دو روش خیساندن دانه در محلول تلقیح و افزودن مایع تلقیح به خاك، مؤثرتر واقع شده و تعداد گرهك های حاوی ریزوبیوم را افزایش داده است؟ به‌نظر شما دلیل این تفاوت در چیست؟
3- با توجه به اطلاعاتی كه در مورد روش تلقیح باكتری ریزوبیوم به گیاهان خانواده لگومینوزه به‌دست آورده‌اید، باغچه ای طراحی كنید كه از روش های میكروبیولوژی بهره برده و به صورت مكانیزه بازده محصولاتش بیشتر از روش‌های سنتی زراعت است.
منابع
1- رحمانی، ابراهیم، فن آوری تثبیت همزیست نیتروژن (راهكارها و كاربردها). انشارات مؤسسه تحقیقات جنگل ها و مراتع، 1379.
2- ریس.جین، و همكاران، كتاب مرجع بیولوژی كمپبل، جلد چهارم. مترجم: گروه مترجمین خانه زیست شناسی. انتشارات خانه زیست شناسی، 1391.
* در سایت زیر می توانید در ارتباط با موضوعات مختلف علوم و گرایش های مختلف زیست شناسی مطالب علمی، فیلم آموزشی، تصاویر مرتبط، ایده ی پروژه و بازی های علمی بیابید:
مطالب مرتبط:
اثر تلقیح باکتری ریزوبیوم بر محصولات کشاورزی، جلسه اول
اثر تلقیح باکتری ریزوبیوم بر محصولات کشاورزی، جلسه دوم
اثر تلقیح باکتری ریزوبیوم بر محصولات کشاورزی، جلسه سوم
اثر تلقیح باکتری ریزوبیوم بر محصولات کشاورزی، جلسه چهارم
بخش پژوهش های دانش آموزی تبیان، تهیه: مهبان رحیمی فرد
تنظیم: زینب شاه مرادی
