تبیان، دستیار زندگی
یکی از منحصر به فردترین موارد در وسترن بلات وجود بلات در این تکنیک است. این بلات که گونه ای از کاغذ به همراه مواد دیگر است بستری جهت انتقال پروتئین است. ...
عکس نویسنده
عکس نویسنده
بازدید :
زمان تقریبی مطالعه :

وسترن بلات 2

اهداف:

  • آشنایی با انواع بلات های مهم وسترن بلات
  • آشنایی با انتقال پروتئین ها از ژل به غشا
  • آشنایی با انواع بلات

شرح درس:

یکی از منحصر به فرد ترین موارد در وسترن بلات وجود بلات در این تکنیک است. این بلات که گونه ای از کاغذ به همراه مواد دیگر است بستری جهت انتقال پروتئین است.

در قسمت قبل خواندید..

تا کنون نیتروسلولز، پلی وینیلیدین دیفلوراید (PVDF)، کاغذهای فعال شده و نایلون برای اتصال پروتئین ها مورد استفاده قرار گرفته اند. نیتروسلولز، غشایی که بیش از سایر غشاها نیز مورد استفاده قرار می گیرد، کارآیی بالایی ندارد زیرا پروتئین ها از طریق پیوند کووالانسی به آن متصل نمی شوند، ضمن این که این غشا پس از خشک شدن بسیار ترد و شکننده است.

پروتئین های کوچک تمایل به خروج از روی این غشا را دارند و تنها بخش کوچکی از کل پروتئین به غشا متصل می ماند. در این موارد استفاده از غشاهایی با روزنه کوچک تر می تواند تاحدود زیادی این مشکل را بر طرف نماید.

نیتروسلولزهای پوشیده شده از ژلاتین برای آنالیزهای با هدف مقایسه کمی مورد استفاده قرار گرفته است. علاوه بر این در برخی از غشاهای نیتروسلولزی خاصیت مکانیکی این غشا از طریق ترکیب کردن با پلی استر بهبود یافته و جا به جایی آن ها آسان تر شده است.

غشاهای PVDF بسیار سودمند هستند زیرا ظرفیت اتصال پروتئین بسیار بالایی دارند. از سوی دیگر انعطاف پذیر بوده و پایداری شیمیایی مناسبی دارند و یکی از مزایای الکتروبلات پروتئین ها روی این نوع غشاها قابلیت ایجاد تکرارهای مختلف از یک ژل الکتروفورزی است.

لینک فیلم:

  • زیست شناسیوسترن بلات 1
  • توضیح فیلم:

    پروتئین های روی ژل ساخته شده توسط میدان الکتریکی به جریان در آورده می شوند. سپس ژل در میدان دیگری قرار داده می شود و این کار سبب انتقال پروتئین از ژل به روی بلات می گردد.

    انتقال پروتئین ها از ژل به غشا

    به طور کلی انتقال پروتین ها از ژل به غشای نیتروسلولوزی و یا PVDF از سه طریق صورت می گیرد:

    1- انتشار ساده
    2- انتشار تسهیل شده با خلاء
    3- جریان الکتروفورزی
     

    انتشار ساده

    این سیستم در ابتدا برای انتقال پروتئین هایی که با روش ایزوالکتریک فوکوسینگ از هم جدا شده بودند ایجاد شد. در این روش دو غشا بر دو سطح یک ژل قرار داده می شوند و سپس در دو طرف آن ها کاغذ صافی خشک قرار می گیرد. در انتها یک صفحه شیشه ای در دو طرف آن ها قرار داده می شود و یک وزنه روی آن ها قرار می گیرد تا انتقال به نحو بهتری انجام گیرد. از آن جایی که انتقال پروتئین با این روش قابل ارزیابی کمی نمی باشد این روش مورد قبول بسیاری از مراکز تحقیقاتی قرار نگرفته است.

    انتشار تسهیل شده با خلاء

    این روش جایگزینی برای روش های انتشار ساده و الکتروبلات محسوب می شود. در این روش به وسیله خلا بالایی که ایجاد می شود پروتئین ها از ژل مکیده شده به غشای متصل به ژل رسیده و روی آن تثبیت می شوند. در انتشار تسهیل شده با خلا هم پروتئین های با وزن مولکولی بالا و هم پروتئین های با وزن مولکولی پایین بخوبی منتقل می شوند. ضمن این که باید توجه داشت که با استفاده از بافرهای مناسب و نیز زمان مناسب (کمتر از 45 دقیقه) مانع از خشک شدن ژل و غشا شد.

    بلات الکتریکی

    بلات الکتریکی مرسوم ترین روش برای انتقال پروتئین ها از ژل به غشا به شمار می رود. ویژگی اصلی این روش سرعت و حجم بالا و انتقال تقریبا کامل پروتئین ها نسبت به دو روش اخیر می باشد. بلات الکتریکی می تواند از طریق قرار دادن ژل و غشا و کاغذهای صافی به طور کامل در بافر الکتروفورز (روش مرطوب) و یا قرار دادن ژل و غشا بین دو کاغذ صافی که بافر انتقال را جذب نموده اند (روش نیمه خشک) انجام گیرد.

    بلات الکتریکی با روش غوطه ور (مرطوب):

    در این فرایند ژل، غشا و کاغذهای صافی که در این حالت به اصطلاح به آن ساندویچ گفته می شود در محفظه بافر بین دو الکترود قرارداده می شوند. سپس با بر قرار کردن جریان الکتروفورز، پروتئین ها از ژل به غشا منتقل می شوند. باید توجه داشت که ژل رو به کاتد (منبع الکترون) و غشا رو به قطب آند باشد. از مزایای این روش امکان انتقال بهتر پروتئین های با وزن مولکولی بالا می باشد.

    بلات الکتریکی با روش نیمه خشک

    در این روش ساندویچ ژل، غشا و کاغذهای صافی بین دو الکترود قرارداده می شوند. باید توجه داشت که کاغذهای صافی به خوبی بافر انتقال را جذب کرده باشند و نیز حباب های ایجاد شده بین غشا، ژل و کاغذعای صافی با استفاده از یک غلطک گرفته شود. مانند روش مرطوب محل قرار گرفتن ژل و غشا باید طوری باشد که پروتئین ها پس از خروج از ژل به غشا برسند.

    ویژگی های این روش عبارت اند از:

    1-- بلات همزمان چند ژل
    2- الکترود های ارزان
    3- نیاز به ولتاژ پایین.


    مرکز یادگیری سایت تبیان - تهیه: فاضل صحرانشین سامانی

    تنظیم: مریم فروزان کیا